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PVA作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的可能性初探(庞楠)

 

 

 

第四军医大学

学 位 论 文

 

PVA¾作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的可能性初探

 

 

 

庞楠

 

 

 

 

指导教师姓名

邹敬才  教授(主医师)

指导教师单位

第四军医大学唐都医院整形口腔科

申请学位级别

硕士

专业名称

口腔临床医学(颌外)

论文提交日期

2010.04

答辩日期

2010.05

论文起止时间

200810月至20104

学位授予单位

第四军医大学

独 创 性 声 明

 

秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。

 

           论文作者签名:             日期:              

保 护 知 识 产 权 声 明

 

本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采用影印,缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅,并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》,同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。

 

   论文作者签名:         导师签名:           日期:           

 


 

PVA¾作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的可能性初探

 

 

 

 

研 究 生:庞楠      

学科专业:口腔临床医学(颌外)

所在单位:第四军医大学唐都医院整形口腔科

    师:邹敬才  教授(主任医师)

辅导教师: 荀文兴 副主任医师

 

 

 

 

资助基金项目:陕西省自然科学基金计划项目

关键词: 组织工程牙齿 聚乙烯醇 支架材料 牙髓细胞 矿化诱导

 

 

中国人民解放军第四军医大学

20105



 

缩略语表

 

缩略词

英文全称

中文全称

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

PVA¾作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的可能性初探

硕士研究生

:庞楠

     

:邹敬才  教授

第四军医大学唐都医院整形口腔科,西安 710038

 

中文摘要

种子细胞、支架材料以及生长因子微环境是构建组织工程人工牙的三要素,而牙髓牙本质复合体是牙齿的主体,也是构建组织工程化牙齿的第一步。因此,优选适宜的种子细胞以及性能良好的支架材料成为组织工程牙髓牙本质复合体研究中的重要内容。

在以往的研究中,人们用多孔羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite ceramic-tricalcium phosphateHA-TCP) 生物陶瓷、Collagraft、聚羟基乙酸(polyglycolic acidPGA)等支架材料和种子细胞相复合,然后移植到实验动物的体内构建组织工程化牙髓牙本质复合体,并取得了初步的成果。但用这些支架材料所构建的牙髓牙本质复合体样物质具有一个共同的缺陷:即多数形成的是混杂有管状牙本质和非特异性矿化基质的组织团块,而不是真正意义上的牙髓牙本质复合体。这可能是由于支架材料本身性能的影响。因此,寻找一种新型的支架材料就显得尤为重要。

由于具有良好的亲水性,聚乙烯醇polyvinyl alcoholPVA)在生物医学领域一直得到广泛的应用。有研究表明,PVA可通过抑制ERK1/2信号途径,从而诱导牙胚细胞矿化分化。由此我们可以推测,如果PVA对形成牙髓牙本质复合体的种子细胞具有矿化诱导作用,那么用该种子细胞接种于PVA三维支架材料,辅以适当的生长因子微环境,再在裸鼠体内移植,是否可形成较为成熟的牙髓牙本质复合体呢?想要证明这一点,首先要证明PVA本身即可诱导构建牙髓牙本质复合体的种子细胞矿化分化。因此,本实验采用SD大鼠牙髓细胞为实验细胞,分别以PVA及矿化诱导液对第四代SD大鼠牙髓细胞进行矿化诱导,结果表明PVA本身对大鼠牙髓细胞具有良好的矿化诱导性能,初步探索了PVA作为构建组织工程牙髓牙本质复合体支架材料的潜在可能性。

关键词:组织工程牙齿 聚乙烯醇 支架材料 牙髓细胞 矿化诱导


 The Preliminary Exploration of PVA 

------ the potential possibility of PVA as pulp-odentinal complex scaffold material in tissue engineering

                   

Candidate for master: Pang Nan

Supervisor: Zou Jingcai

Department of orthopaedics,tangdu hospital, Fourth Military Medical University,

Xi’an  710038, China

 

Abstract

Seed cells, scaffold materials and growth factors in micro-environment is the three elements for the construction of artificial teeth in the tissue engineering, while the pulp-odentinal complex is the main body of the teeth, but also the first step to build the teeth in tissue engineering. Therefore, the optimization of appropriate seed cells and scaffold materials with good performance become the important content in the study of pulp-odentinal complex in the tissue engineering.

In previous studies, researchers mixed scaffold materials which include HA-TCP, bio-ceramics, Collagraft, PGA, etc, and seed cells. Then they  transplanted the mixture into experimental animals to build the pulp-odentinal complex in the tissue engineering. They have obtained initial achievements. However, in this way, these dental pulp -dentin complex have a common flaw. That is, most of them are organization clumps which mixed the tubular dentin and non-specific mineralized matrix, rather than true pulp-odentinal complex. This may be influenced by the property of scaffold materials. Therefore, the search for a new type of scaffold material becomes particularly important.
    Due to the good hydrophilicity, PVA in the biomedical field has always been a wide range of applications. Some studies have shown PVA may inhibit the signaling pathways of ERK1 / 2. Next, PVA induce tooth germ cell to mineralize. Therefore, we can speculate that PVA has induced mineralization to the seed cells of forming pulp-odentinal complex. If the seed cells were inoculated in the PVA three-dimensional scaffold materials, and supplemented by appropriate growth factors in micro-environment, and then transplanted to the vivo of nude mice, could they become a more mature dental pulp-odentinal complex? In order to prove this, we must prove that PVA itself can induce and build the seed cells of pulp-odentinal complex to mineralize. Therefore, in the experiment, we use SD rat dental pulp cells as the experimental cells. We use PVA and the fluid of induced mineralization to the fourth generation of SD rat dental pulp cells respectively. It shows that the PVA itself is good for induced mineralization of the rat dental pulp cells. We explored the potential possibility of the PVA as pulp-odentinal Complex scaffold materials in tissue engineering preliminarily. 

Key wordsthe teeth of tissue engineering, PVA (polyvinyl alcohol) scaffold materials, dental pulp cells, induced mineralization


 

   

许多细胞均可作为组织工程牙髓牙本质复合体研究中的种子细胞,如牙髓细胞、牙髓干细胞、牙乳头细胞、牙胚细胞等。其中牙髓细胞是一种成纤维细胞,是牙髓组织在损伤、感染的情况下,具有自身修复能力的生物学基础。许多研究表明,牙髓细胞在矿化诱导液(通常为含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C完全型DMEM培养液)的作用下可分化为成牙本质细胞。

    由于具有良好的亲水性,PVApolyvinyl alcohol,聚乙烯醇)在生物医学领域一直得到广泛的应用。有研究表明,PVA可通过抑制ERK1/2信号途径,从而诱导牙胚细胞矿化分化。但是PVA是否对其它牙源性种子细胞也有类似的作用尚未见报道。因此,本实验的目的即在于通过与常规矿化诱导液对牙髓细胞作用的对比,探讨PVA对牙髓细胞的矿化诱导作用,从而展示其在组织工程牙髓牙本质复合体研究中作为支架材料的潜在可能性。

本实验包括以下内容:

取材于3周龄SD大鼠的前牙牙髓进行牙髓细胞的原代培养、鉴定及传代,取第四代牙髓细胞,分别以常规矿化诱导液及PVA诱导培养,对比检测其ALP alkaline phosphatase碱性磷酸酶)活性、ARS alizarin red s,茜素红)量化分析,再以PVA诱导培养2周的牙髓细胞进行矿化结节染色,通过以上检测指标来证明PVA本身是否对牙髓细胞具有矿化诱导能力。

本实验证明了PVA本身即具有诱导SD大鼠牙髓细胞矿化分化的能力,为进一步将牙髓细胞接种于PVA三维支架材料体内移植构建牙髓牙本质复合体奠定了理论基础。


 

文献回顾

组织工程化牙髓牙本质复合体的研究进展

要想成功的研制出组织工程牙髓牙本质复合体,离不开3个基本的条件:即适宜的种子细胞、良好的支架材料及生长因子微环境。以下就以这3个基本条件为基本点做一概述。

1.牙髓牙本质复合体组织工程化所依赖的种子细胞

1.1 牙髓细胞                                                           

牙髓细胞是牙髓的主体细胞,它是一种成纤维细胞,其主要功能是形成和维持牙髓基质。牙髓细胞具有分化为成牙本质细胞进而形成牙本质的能力,而具有同样胚胎起源的牙龈成纤维细胞并不具备这种能力。已有许多学者使用矿化诱导液通常为含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的完全型DMEM培养液)将体外培养的牙髓细胞矿化诱导为成牙本质细胞,或采用生长因子如TGF-β(transforming growth factor-β,转化生长因子β)BMP7 (bone morphogenetic protein7骨形成蛋白7)诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化,甚至已形成了和体内特征相似牙本质样物质[12]Mooney等将成年人牙髓细胞体外培养扩增后接种于聚乙醇酸纤维的三维立体支架上后,牙髓细胞增殖、分化,同时支架材料自行降解,2后即形成了组织工程化牙髓组织[3]。朱轶萍,张光东等将原代牙髓细胞接种于处理过的离体牙髓腔内,利用牙本质固有的特殊的三维空间结构,将原代牙髓细胞诱导为成牙本质细胞样细胞。显微镜下观察发现牙髓细胞在牙本质表面生长良好,部分细胞伸出胞质突伸入牙本质小管中,表现出成牙本质细胞样细胞的形态[4]

1.2 牙髓干细胞

Gronthos认为牙髓干细胞就是指从成体牙髓组织中通过体外培养,获得集落状生长的、体外可诱导分化形成牙本质样结构的、具有自我更新和多向分化潜能的成牙本质细胞的前体细胞[5]。这一概念是他在2000年用酶消化法离体培养人未发育完成的阻生恒磨牙牙髓,结合干细胞理论,并在与骨髓基质干细胞对比研究的基础上提出来的。其后,他又将牙髓干细胞接种到HA/TCP复合型支架材料上,移植于裸鼠体内,6周后组织学观察发现形成了与天然牙髓牙本质复合体在各方面都十分相似的牙髓牙本质复合体样组织。这一研究成果展示了牙髓干细胞在组织工程化牙髓牙本质复合体研究中的诱人前景。2005年郭红岩等利用大鼠牙髓干细胞在裸鼠体内移植构建组织工程化牙髓牙本质复合体的尝试也获得了成功[6]

牙髓干细胞具有取材广泛、操作相对简便等优势,在将来的某一天,也许我们可以利用未发育完成的阻生第三磨牙以及因正畸治疗的需要所拔除的前磨牙牙髓分离培养牙髓干细胞,进行体外培养扩增,形成产业化的干细胞库,然后再采用组织工程技术及免疫学技术体外形成无抗原性的人工牙髓或牙髓牙本质复合体,当有患牙髓炎的患者就诊时,可将商品化的人工牙髓移植于患者体内,以修复或替代病变牙髓,使原本无法保留活髓的牙枯木逢春。这将会是牙体牙髓病治疗史上的一个里程碑,它甚至可以替代传统的根管治疗。另外,人工生物活性牙齿的构建是近年来研究的热点,而构建组织工程人工牙的第一步便是构建组织工程化牙髓牙本质复合体。它的成功构建对于将来应用用组织工程化活性牙齿修复牙齿缺失具有重要意义,亦是口腔修复学治疗史上的重大变革。由于尚未发现牙髓干细胞的特异性表面标志、并且其组织学定位尚不十分确定,以及如何更有效的分离和纯化还缺乏深入细致的研究,它在组织工程应用中还存在很多问题。

1.3 牙乳头细胞

内釉上皮下方的外胚间充质组织称牙乳头,其细胞由脑神经嵴细胞迁移分化而来,是具有较强增殖分化能力的前体细胞,称为牙乳头细胞。它具有进一步分化为成牙本质细胞和牙髓成纤维细胞的能力。有学者用添加有aFGF acid fibroblast growth factor酸性成纤维细胞生长因子bFGF bovine basic fibroblast growth factor重组牛碱性成纤维细胞生长因子)IGF-1 insulin-like growth factor-1胰岛素样生长因子1生长因子的培养基体外培养牙乳头细胞,,发现其可向成牙本质细胞分化,甚至在aFGFβ1协同作用下,还形成牙本质基质。而牙乳头细胞在矿化诱导液培养条件下亦可分化为成牙本质细胞,形成与牙本质结构相似的矿化结节[7]。这些研究大多为二维细胞体外培养技术,而正常牙乳头的三维结构形态对于其生理功能的发挥是非常关键的,因此我们需要在体外模拟正常牙乳头的疏松三维结构,即建立牙乳头细胞三维立体培养体系。中外学者已在此方面开展了大量的研究:Kikuchi[8-9]将大鼠牙乳头细胞接种于三维结构的琼脂凝胶表面,以纤连蛋白修饰后的琼脂凝胶作为培养支架,细胞分化为成牙本质细胞,分泌管状牙本质基质,牙乳头细胞合成基膜样物质并沉积在细胞表面。该实验模拟了牙乳头细胞在体内分化为成牙本质细胞的过程,初步形成了牙髓牙本质复合体样物质。第四军医大学组织工程实验室将人牙乳头细胞接种于复合生长因子(TGF-β1bFGFIGF-1)CBBCollagraf支架材料上上,移植于裸鼠体内,形成了牙髓牙本质复合体样结构。郝建军等将端粒酶基因以基因转染的方法整合到大鼠牙乳头细胞后,细胞获得了永生化并表达成牙本质细胞的特异性标志物DSPPDMP1。用矿化诱导液培养该细胞可形成与牙本质的结构相近的矿化结节。将该细胞接种于胶原支架并移植于SD大鼠背部的皮下和肌肉内,通过定期的X线检查,发现植入物有矿化程度逐渐增高的趋势。切取部分植入体在显微镜下进行组织学分析,可见矿化基质环绕在成牙本质细胞样细胞周围。张富强,傅远飞等将第1代猪牙乳头细胞接种于β-磷酸三钙支架材料后移植于在裸鼠皮下,8周后取材进行组织学(苏木精-伊红染色及Goldner'三色法染色)、牙本质涎蛋白免疫组织化学及透射电镜检测。组织学染色发现在支架材料孔隙内形成了牙髓牙本质复合体样结构,该结构含有牙本质基质样物质、前期牙本质样物质及牙髓样组织。在牙本质样物质内部可见少量牙本质小管,牙髓样组织外层细胞呈单层排列,表现出成牙本质细胞样细胞的特征;免疫组织化学染色显示,在邻近成牙本质细胞样细胞周围的前期牙本质内牙本质涎蛋白呈阳性表达;透射电镜结果显示,移植物局部可见牙本质小管样结构[10]

1.5 牙源性外胚间充质细胞

    牙齿的发育是在牙源性上皮与外胚间充质相互作用下的复杂过程,颅神经嵴细胞群迁移至上颌突与第一鳃弓便形成了一群多能干细胞,称为牙源性外胚间充质细胞[6]。它们可分化为一系列不同的牙源性细胞,如牙乳头细胞、成牙本质细胞、成牙骨质细胞、牙周膜细胞等,最终形成牙周组织、牙髓和牙本质等组织器官。可见,外胚间充质细胞在牙齿发育过程中起着重要的作用,如能在组织工程化牙髓牙本质复合体研究中善加利用,其能带来的进展是非常诱人的。为此,学者们作了大量的研究。Narayanan[11]将牙本质基质蛋白-1转染至胚胎间充质细胞后,成功诱导分化出了成牙本质细胞样细胞。张光东等[12]初步发现胰岛素样生长因子-1对外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化具有一定的诱导作用,这将有益于进一步探讨外胚间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制。2004年包柳郁等[13]将体外培养的人牙源性上皮细胞和经生长因子诱导后的牙源性间充质细胞分层接种于经塑形的CBB ceramic bovine bone,陶瓷化骨)Collagraft三维支架上,将其移植到免疫缺陷小鼠的皮下。14~18周后切取移植物,采用HE染色、改良丽春红三色法、免疫组化和原位杂交方法检测移植物。发现细胞在三维支架上形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。2005年,他们又建立起了一种行之有效的人牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化的体外诱导方案。该试验小组应用bFGF+IGF-1TGF-β1分别对培养早期的人牙源性间充质细胞进行平面定向诱导,诱导后的部分细胞出现了成牙本质细胞的形态和功能特征:这些细胞具有了单侧较长的细胞突起,能够表达DSP hentin sialoprotein牙本质涎蛋白)蛋白和DSPP dentin sialo-phosphoprotein 牙本质磷涎蛋白)mRNA,体外连续培养可自发形成矿化结节[14]

2     应用于牙齿组织工程研究的支架材料

支架材料是一种多孔状的替代细胞外基质的材料,它适于细胞的生长,并且能够引导细胞在三维支架结构上形成组织或器官。理想的支架材料应具有以下特点:1.生物相容性好,在体内不引起炎症反应、排异反应。2.有可吸收性,能彻底地被自身组织所取代。3.应具有三维立体多孔结构。4.表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长。5.降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。6.应具有合适的机械性能,为新生组织提供适宜的力学环境。目前,在组织工程领域常用的支架材料有:1. 聚合物材料 有天然聚合物材料和人工聚合物材料两种。天然聚合物材料如胶原、纤维蛋白等。它们生物相容性好,具有细胞识别信号,利于细胞粘附、增殖和分化。并且来源丰富,造价低廉,有些材料甚至具有天然的孔隙结构系统。但其最大的缺点是不同批次差别较大。此外,其机械性能也不理想。人工合成聚合物包括如聚乳酸、聚乙醇酸等。它们可以被加工成各种结构形状。并且由于其降解产物无毒及良好的生物相容性,PLAPGA已被美国食品与药品管理局批准广泛用作医用缝线、暂时性支架和药物控释载体。2.金属和陶瓷材料 金属材料有不锈钢、钛合金等,陶瓷类材料如氧化铝、生物玻璃等都在医学领域有广泛的应用,但是由于难以降解和加工困难,在组织工程学领域应用较少。3.复合材料 如将聚合物材料和陶瓷类材料相结合,则可克服单独的两种材料固有的缺点,取长补短。如可吸收陶瓷类(羟基磷灰石、磷酸四钙等)材料不仅具有良好的生物活性和生物相容性,并且在体内可以自动降解。

    目前,在牙齿组织工程领域常用的支架材料有如下几种。

2.1 陶瓷化骨

    CBB为利用牛肋骨、胫骨上端或股骨下端的骨松质作为原料,在马佛炉中800持续煅烧3 h而制得,具有天然的骨小梁结构和小梁间隙。虽然的主要成分是羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),但它比人工合成的HA更有利于细胞的生长和分化更易形成矿化组织,同时具有来源丰富、制备简单、经济成本低等优点[15]。以前,CBB仅在骨组织工程中得到了广泛的应用,由于牙齿在基质形成和生物矿化上与骨有一定的相似性,所以, 有学者将CBB引入到牙齿组织工程研究之中。包柳郁等将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞接种于天然珊瑚、陶瓷化骨进行体外培养,作为相互对照。采用扫描电镜和细胞计数法观察和比较细胞在各种三维支架中的生长、增殖情况。结果发现细胞在陶瓷化骨表面生长良好,增殖活跃,而在天然珊瑚表面附着的细胞数量很少,伸展不够充分,增殖也不明显[16]

2. 2 胶原类材料

    胶原是哺乳动物体内主要的结构蛋白,其来源丰富。用胶原制作的支架材料无抗原性,并且生物相容性好,已经在创面敷料、骨移植替代材料、组织再生诱导物方面得到了广泛的应用[17]。胶原本身即可引导细胞对支架材料的特定的识别,有助于保持许多细胞的表型及活性[18]。牙齿各部组织的有机成分主要是胶原,以Ⅰ型胶原为主。胶原类材料有利于细胞的贴附和生长,并可作为生长因子和缓释微囊的载体,但是无法为细胞生长提供矿物离子环境,且坚韧性不高。因此不适于作为牙组织工程中单一的支架材料使用,但可作为牙齿组织工程研究中较好的辅助性支架材料。

2. 3 人工合成的高分子材料

    人工合成的高分子材料,属于人工聚合物材料,在牙齿组织工程中常用的是PGAPLA和聚乳酸聚羟基乙酸材料,它们的优点是:①具有良好的生物相容性、生物降解性和可吸收性;②极易塑形,可根据需要加工成各种形状和大小;③具有多孔性结构和一定的坚韧性,可给予种子细胞渗透和新生组织生长繁殖提供足够空间。Mooney[3]将人牙髓细胞接种到PGA支架材料上进行体外培养, 60 d后形成了人牙髓样组织。初步建立了组织工程牙髓。但还未能投入临床使用。将来当其研制成熟后,可植入因不可复性牙髓炎而去髓的牙髓腔内,彻底改变牙体牙髓病治疗的理念,实现真正意义上的“保髓”治疗。

2. 4 复合型材料

    复合性材料是一种将有机型材料和无机型材料相整合的材料。由于牙齿本身存在着有机和无机两种成分,因此更适于构建组织工程化牙齿组织。较常用的是HA/TCP(磷酸三钙)/胶原和CBB/胶原。Collagraft材料由于同时具有有机和无机型支架材料的优点,已被广泛的应用于牙齿和骨组织工程领域,它由美国Zimmer公司生产,其主要成分是HA/TCP少量胶原,有颗粒和块状两种剂型。CBB/胶原材料为在陶瓷化骨表面涂布胶原材料制成,它既可发挥陶瓷化骨的优点,即可为牙齿组织的形成提供良好的矿物离子环境,又克服了陶瓷化骨亲湿性不高的缺陷,更有利于细胞的附着和生长。牙本质牙髓复合体是一种软硬共存的组织,因此需要一种适合软硬组织来源细胞的共同生长的支架材料,这样就有望构建出牙本质和牙髓组织有序相接的生理性牙髓牙本质复合体样结构。2004年,Bitar等便开发出了这样的材料,它是一种(CaO)-(Na2O)-(P2O5)复合物,可保证能够矿化分化的细胞以及能合成软组织基质的细胞共同生长于其中,并保持稳定的表型。

3 适宜诱导微环境的创造

    这里的局部微环境主要是指影响细胞生存、增值和分化的生长因子微环境。生长因子是一类多肽因子,它可以通过自分泌,旁分泌,内分泌作用,促进或抑制细胞生长,繁殖,迁移,贴附和基因表达。组织工程局部诱导微环境的创造,是通过利用动物体内滋养环境和在支架材料中加入各种诱导成分,如生物活性因子等来实现的,由于成牙的微环境十分复杂,涉及到各种基质成分、矿物离子和生长因子等[11,19,20],单纯依靠支架材料的引导作用不足以形成牙齿样结构,还需要加入各种生长因子并移植于动物体内。上皮-间充质相互作用的时空表达调控引起了牙胚的发育和细胞的分化,在牙齿发生的初期,上皮-间充质相互作用并分泌生长因子,这些因子促进牙源性细胞的增殖、迁移、极化和分化,最终调控牙胚的形成。目前发现与牙胚发育和分化关系密切的生长因子有BMPTGFWnt基因家族、EGF (epidermal growth factor表皮生长因子)等。

3.1 骨形成蛋白

1965年,Urist发现兔的脱钙冻干骨可以诱导肌肉内成骨。在接下来的进一步研究中,发现了骨形成蛋白这一生长因子,它是从成年哺乳动物的脱矿骨基质中萃取出来的。BMP属于TGF-β超家族成员中的两种亚型,是一种多肽类的生长因子,分别由396408个氨基酸组成,92%的氨基酸基因相同。在牙齿发育中参与了釉上皮¾间充质相互作用的诱导过程。重组骨形成蛋白6和重组骨形成蛋白5能够起类似于牙上皮细胞的作用从而诱导间充质细胞分化。除了存在于成年哺乳动物的骨基质中,在釉结、成牙本质细胞和成釉细胞中也可萃取出BMP。张慧宇等用MMT比色法检测不同浓度rhBMP2作用下,牙髓细胞增殖活性的变化;用酶动力学方法检测不同浓度rhBMP2作用下牙髓细胞ALP活性的变化。发现低浓度的rhBMP2可提高体外培养人牙髓细胞的增殖活性,浓度为200ng/mL,增殖活性达到最大值,并可促进人牙髓细胞ALP活性,呈浓度依赖性[21]BMP也可诱导成牙本质细胞分泌牙本质基质。有学者分别将500ng/ml100ng/mlBMP-7导入大鼠牙厚切片培养液中,7天后测定形成的继发性牙本质的厚度,发现500ng/ml组为32.25um,而100ng/ml组为26.57um,两者无明显差异。表明BMP-7能诱导成牙本质细胞形成牙本质基质,浓度对其无明显影响。由此可见,BMP在构建组织工程化牙髓牙本质复合体的研究中是可以充分应用的。

3.2  转化生长因子                                                                    

  TGF是一类同源双链多肽蛋白,它不仅充当秞上皮和间充质之间相互作用的重要的信号分子,通过自分泌和旁分泌调节细胞的分化,在牙齿形态发育过程中发挥重要作用,且在成体牙髓中也能诱导成牙本质前体细胞分化和牙本质基质的分泌,从而促进牙髓牙本质复合体的形成。Shirakawa等研究了TGF-β1对人牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及DNA合成的影响,发现0.1ng/ml TGF-β1可增高一个培养牙髓细胞系的ALP活性及促进DNA合成,而在5 ng/ml时可降低所有培养牙髓细胞的ALP活性,增加其DNA浓度,表明TGF-β1是人牙髓细胞的丝裂原,在ALP mRNA转录后、翻译前的时间段内调节ALP活性 [22]。聂鑫等取人阻生第三磨牙牙髓组织,并将其剪碎后与牙本质陶瓷及2μg/mL TGF-β1混合,然后将混合物接种于骨基质明胶来构建牙髓组织培养模型,在培养371421 d,通过HE和组织特异性染色鉴定有无骨-牙本质基质成分形成,采用免疫细胞化学技术鉴定细胞有无DSP的表达。发现牙髓组织经TGF-β1诱导培养后可发生矿化,甲苯胺蓝和Mallory染色表明在培养的牙髓组织中心出现骨-牙本质样基质的沉积,免疫细胞化学检测发现牙髓细胞DSP呈阳性表达。该实验证明了TGF-β1具有诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化的能力[23]。此外,TGF-β1还可以促进牙髓干细胞的增殖和分化,0-5mg/ml范围内随剂量增加而效应增强,大于5mg/ml,再增加浓度其诱导能力并不会增强。该现象的一个较为合理的解释为:生长因子的作用效应不仅与生长因子本身的性质,如种类、浓度、作用时间有关,而且也与靶细胞膜上的受体数量有关,当细胞因子与受体达到饱和后,即使浓度再增加也不能增强其作用[24]

3.3  成纤维细胞生长因子

FGF具有多重生物学效应,例如它可以促进细胞有丝分裂、血管形成、神经营养及创伤愈合等,特别是对中胚层和神经外胚层来源的细胞有丝裂原和形态发生的作用。FGF直接参与牙齿发育形成、牙髓的修复再生。张颖丽等在体外培养人牙髓细胞的培养液中添加FGF,采用MTT比色法测定bFGF对牙髓细胞的影响。结果发现bFGF1~100ng/ml浓度范围内,可促进人牙髓细胞的增殖,10ng/ml的浓度下bFGF促增殖作用最强[25]。该实验为体外进行牙髓细胞的大规模培养提供了一种参考方案,并对牙髓康复治疗具有一定的意义。贺慧霞等采用MTT法测定了bFGF对人牙髓干细胞增殖能力的影响。通过ALP活性检测、细胞形态学观察及DSPDMP-1免疫细胞化学技术来检测其对人牙髓干细胞分化能力的影响。发现0~40 ng/mL范围内,bFGF能显著促进人牙髓干细胞的增殖并矿化分化[26]。成纤维细胞生长因子与其他细胞因子相互作用,亦参与了成牙细胞的增殖与分化过程。例如,向体外培养的小鼠牙乳头细胞培养基中添加TGF-β1FGF1,小鼠牙乳头细胞可分化为成牙本质细胞样细胞,而且这种细胞能分泌细胞外基质,并有ALP活性;而当添加了TGF-β1FGF2共培养时,仅能诱导细胞向成牙本质细胞样细胞分化,无法分泌牙本质基质。表明TGF-β1FGF1对成牙本质细胞的形态分化和功能活动具有协调作用,FGF2可能调节TGF-β1的作用,使培养细胞分化为成牙本质细胞样细胞,但抑制所形成的成牙本质细胞样细胞的功能。同时也说明前成牙本质细胞体外分化中存在着形态和功能相分离的现象。只有功能性成牙本质细胞才能形成牙本质或牙本质样组织。

3.4 Wnt基因家族

Wnt基因家族编码的分泌型蛋白,与细胞表面的特异性受体Frizzled蛋白相结合,激活通道下游分子,以此来保证生牙的正确位置、调控牙齿形态和影响牙齿大小,是启动牙胚发育和调控牙齿形态发生的重要因子[27]

 

   牙齿是机体高度特化的器官,其形成受极其复杂的、精细的信号分子网络调控。组织工程化牙齿的研究大多数仅限于牙齿的部分组织,其中最重要的是牙髓牙本质复合体的组织工程化研究。但在目前,无论是种子细胞来源、适宜的支架材料还是各种细胞因子的研究均不完善,尚需进行大量的实验。相信在不久的将来,随着相关学科的飞速发展以及中外学者的不懈努力,成功的构建出组织工程化牙髓牙本质复合体进而构建组织工程化人工牙并应用于临床的宏伟目标一定会实现。

 

 

 

 

   

 

实验一

大鼠牙髓细胞的体外培养、鉴定及细胞蛋白含量的测定

1 材料

1.1 实验所需要的试剂、材料和设备

1.1.1 主要试剂

1.1.1.1 高糖型DMEM培养基Gibco,美国)

1.1.1.2 Ⅰ型胶原酶(Invitrogen,美国)

1.1.1.3 胰蛋白酶(Sigma,美国)

1.1.1.4 新生牛血清(fetal calf serum,FCS,杭州四季青生物工程材料有限公司)

1.1.1.5 波形丝蛋白、角蛋白一抗及即用型SABC试剂盒(武汉博士德公司)

1.1.1.6 D-Hanks缓冲液(第四军医大学唐都医院中心实验室提供配方,自制)

1.1.1.7 青霉素、链霉素(第四军医大学唐都医院中心实验室提供)

1.1.1.8 谷氨酰胺(第四军医大学唐都医院中心实验室提供)

1.1.2 主要材料

1.1.2.1 周龄清洁型雌性SD大鼠(第四军医大学动物中心)

1.2 仪器设备

1.2.1  50ml商品塑料培养瓶(Gibco ,美国)

1.2.2  HHW-21CU-600型电热恒温水槽(上海福玛实验设备有限公司)

2 方法

2.1 各种细胞培养用液的配制

2.1.1 DMEM培养基:一袋DMEM粉末用三蒸水溶解(先加入800ml三蒸水,再用少许约50ml三蒸水冲洗袋子)、磁力搅拌器搅拌半小时以上。加入1.2gNaHCO3定容至1000 mL、搅拌30 min。在超净台内用大滤器过滤、分装。4贮存。

2.1.2 青霉素-链霉素双抗具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌三蒸水,即每毫升各为20万单位。 使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml -20贮存

2.1.3 新生牛血清FCS的灭活:将血清加热至56并保持30 min,其间要不时轻轻晃动,使受热均匀,防止沉淀析出。处理后的血清贮存于4

2.1.4 谷氨酰胺液:谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水100ml即配成 200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶, -20 保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

2.1.5 完全型DMEM培养基:使用时可取80mlDMEM培养基加入50µl双抗、20mlFCS1ml谷氨酰胺,即配成100ml完全型DMEM(含20%FCS100单位/ml青霉素,100单位/ml链霉素,2mmol/L谷胺酰胺),4贮存。

2.1.6  D-Hanks缓冲液:将药品(NaCl 8.0gKCl 0.4gNa2HPO4•12H2O 0.12gKH2PO4 0.06g,无水葡萄糖:1.00g)倒入盛有三蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动充分溶解(依次倒入,待一种药品溶解后再倒入另一种),然后把溶液倒入量筒中用三蒸水准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的D-Hanks缓冲液。分装,高压灭菌,4贮存。

2.1.7  2.5g/L胰蛋白酶液:用电子天平准确称取0.25g粉剂溶入小烧杯中的100mlD-hanks液中。搅拌混匀,4过夜。 用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器( 0.22 微米微孔滤膜)抽滤除菌。-20贮存。

2.1.8  0.3%Ⅰ型胶原酶:用电子天平准确称取0.3g粉剂溶入100ml完全型DMEM培养基,搅拌混匀,用注射滤器抽滤消毒,4贮存。

2.2 SD大鼠牙髓细胞的体外培养及鉴定

脱颈处死SD大鼠置于75%酒精中浸泡5min,解剖上、下颌骨,并分离取出上、下颌切牙,放于盛有75%酒精的培养皿中,用小剪刀剪开牙体硬组织,取出牙髓,剪除根尖1/3部分,剩余牙髓组织用含1%双抗的D-Hanks液反复清洗后,剪成1mm3大小移入10 ml的塑料离心管内,加入0.3%Ⅰ型胶原酶37消化30min1000r/min离心5min,弃上清,加入完全型DMEM重悬,再次1000r/min离心5min,弃上清,加DMEM重悬后,将成型组织块转移到小号培养瓶内,并加入含细胞的混悬液和DMEM培养液,反转培养瓶,置于CO2孵箱中孵育,4h后翻瓶。

一周后显微镜下观察有牙髓细胞贴壁生长,更换培养液,继续培养,2天换液一次,待细胞生长达80%汇合时用2.5 g/L的胰酶消化传代。取取生长良好的第4代牙髓细胞制备细胞爬片,用SABC法对细胞爬片进行波形丝蛋白、角蛋白免疫组化染色,鉴定细胞来源。

3 结果

原代培养第7d,倒置相差显微镜下可见细胞从组织块边缘游出,主要是成纤维细胞,呈梭形、星形及不规则形等(2)。原代培养2周后细胞已汇合达80%,可以传代。免疫细胞化学染色抗波形丝蛋白阳性(3),抗角蛋白阴性(图4),证明为中胚层来源的细胞,无上皮细胞混杂。

4 讨论

牙髓是位于牙髓腔内的胚胎性的疏松结缔组织,具有形成牙本质、感觉、营养、修复等重要生理功能。牙髓中的细胞成分主要包括成牙本质细胞、牙髓细胞、未分化的间充质细胞和组织细胞。成牙本质细胞是位于牙髓周围紧接前期牙本质排列的一层柱状或立方状的、具有高度特异性的细胞,能够形成牙本质,是牙髓-牙本质复合体的特征性细胞。但成牙本质细胞很难分离,体外长期培养会导致变性,其形态和分泌牙本质基质的功能均会丧失,因此不宜作为组织工程的种子细胞。要在体外获得成牙本质细胞,首先要解决的就是细胞来源的问题,也就是种子细胞,目前研究比较多的牙本质的种子细胞主要有外胚间充质细胞、牙乳头细胞和牙髓细胞等,把这些细胞在体外培养,进而诱导分化为成牙本质细胞,就可解决成牙本质细胞无法直接在体外培养的难题,从而在构建组织工程化牙髓牙本质复合体占有举足轻重的地位。牙髓细胞是牙髓中的主要细胞,在光镜下,牙髓细胞呈星形、梭形,有胞浆突起相互连接。在电镜下,可以看见细胞有较大的细胞核、丰富的粗面内质网和线粒体,核附近有发达的高尔基复合体,并且有分泌小泡的存在,说明牙髓细胞具有活跃的合成蛋白质的功能。此外,许多研究表明,牙髓细胞可在体外矿化培养环境下向成牙本质细胞分化并形成牙本质。由于牙髓细胞与组织工程牙髓牙本质复合体研究中的其他种子细胞相比,具有数量多,取材方便的优势,并且不像外胚间充质细胞和牙乳头细胞主要存在于胚胎期,获取细胞时必然涉及医学伦理学的问题,因此,它是一种比较理想的种子细胞。故本实验选择牙髓细胞进行体外培养,为下一步实验奠定基础。

    目前,牙髓细胞体外培养主要有三种方法:组织块法、酶消化法和组织块消化法。组织块法操作简单易行,在许多细胞的体外培养中都得到了广泛的应用。组织块能够贴壁是该方法的关键。但即使组织块贴壁了,也不能保证一定有细胞游出,还受到许多条件的限制,如组织来源、供体年龄、组织块大小等[28]。牙髓组织是一种娇嫩的疏松结缔组织,用组织块法培养既简单方便,易于操作,又有较高的成活率,曾经为大多数学者所采用[29-32]。但组织块培养法耗时长,仅原代培养期就需要3-4,并且传代3-4次后细胞生长增殖周期才趋于稳定;另外培养液无法给位于较深部位的细胞提供充分的营养,导致这些细胞会因缺乏营养供给而死亡,死亡后的细胞又释放出大量的有毒物质,从而危害其它细胞的存活。另外一种较常用的体外培养牙髓细胞的方法是酶消化法。常用于消化分离牙髓细胞的主要有胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、dispase[33,34]1991Nakasshima等比较了胰酶、胶原酶以及胰酶和胶原酶联合应用分离培养牛牙髓细胞的效果,发现不同的酶消化牙髓组织后,所释放出的细胞均有3种类型,大多数为有几个突起的成纤维细胞样细胞,少数为细长的梭形细胞和内皮样细胞,这些细胞能很快传代培养,胰蛋白酶和胶原酶联合处理的细胞贴壁、生长情况最好,单用胰蛋白酶的效果最差。因此他们认为,只要选择适宜的酶,控制恰当的条件和时间,酶消化法就可以在较短时间内获取较多数量的细胞,而且比组织块法所获得的细胞更能代表整个组织[35]。彭彬等亦采用了胶原酶及胰酶联合消化的方法来培养人牙髓细胞,所获得细胞也像Nakasshima等的实验结果一样,有3种类型。但细胞贴壁数量少,生长缓慢,难以成功传代[36]。这可能是由于人的牙髓组织量很少,对酶消化法的耐受性较差所致。由于单纯采用酶消化法具有细胞毒性、操作繁琐、易污染等缺点,现已较少采用该方法获取细胞。本实验总结以往研究的经验,采用了组织块消化法,该法既能兼顾组织块法与酶消化法的优点,又弥补了二者的不足。将大鼠牙髓组织块充分剪碎后,再用较少量的消化液(Ⅰ型胶原酶)对其进行短时间的消化,这样就可以使细胞脱离营养环境的时间相对缩短,而且在一定程度上降低了胶原酶对细胞的毒性作用。另一方面,该培养方法使组织块体积减小,结构变松散,于是更加有利于组织块的贴壁,而且组织块的渗透性增强,细胞游出阻力减小,使较深部位的细胞能够得到充分的营养存活及游出生长。结果显示,应用组织块消化法进行大鼠牙髓细胞体外培养,在较短时间内即可获得足量存活的牙髓细胞,而且细胞形态类型多样,更能代表整个牙髓组织。此外,有研究表明,高糖DMEM能提供细胞生长所需高能量、参与合成细胞蛋白质和核酸,商品塑料瓶底涂有胶原膜能支持细胞的攀附;阻挡瓶底表面某些有损细胞的成分,有利于组织块贴附及细胞生长[5],因此,我们吸取前人研究的经验所得,选用高糖型DMEM及塑料培养瓶对大鼠牙髓细胞进行体外培养

综上所述,本实验总结了以往研究的经验,采用组织块消化法获得了大鼠牙髓细胞,建立了牙髓细胞体外培养体系,为下一步进行牙髓细胞的矿化诱导奠定了基础,并为牙髓细胞的大规模培养提供了一种行之有效的方案。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验二

PVA对大鼠牙髓细胞矿化诱导能力的实验研究

1 材料

1.1 实验所需要的试剂、材料

1.1.1.1 高糖型DMEM培养基Gibco,美国)

1.1.1.2 小牛血清白蛋白(第四军医大学唐都医院中心实验室提供)

1.1.1.3 胰蛋白酶(Sigma,美国)

1.1.1.4 新生牛血清(FCS,杭州四季青生物工程材料有限公司)

1.1.1.5考马斯亮蓝G-250(第四军医大学唐都医院中心实验室提供)

1.1.1.6 D-Hanks缓冲液(第四军医大学唐都医院中心实验室提供配方,自制)

1.1.1.7 青霉素、链霉素(第四军医大学唐都医院中心实验室提供)

1.1.1.8 谷氨酰胺(第四军医大学唐都医院中心实验室提供)

1.1.1.9 抗坏血酸(西安舟鼎国生物技术有限责任公司)

1.1.1.10地塞米松(西安舟鼎国生物技术有限责任公司)

1.1.2.1 β-甘油磷酸钠(天津市化学试剂二厂)

1.1.2.2茜素红(天津市科密欧化学试剂有限公司)

1.1.2.3碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)

1.1.2.4聚乙烯醇(国药集团化学试剂有限公司)

1.1.2.5氯化十六烷基吡啶鎓(国药集团化学试剂有限公司)

1.1.2.6 TritonX-100(Genview,美国)

1.1.2.7 5%硝酸银液、5%硫代硫酸钠溶液、0.1 mol/L甲次砷酸钠溶液等行Von Kossa染色所需要的试剂均由第四军医大学唐都医院中心实验室提供

细胞来源:取自实验一所培养的第四代SD大鼠牙髓细胞。

1.2 仪器设备

1.2.1  24孔聚苯乙烯细胞培养板(西安舟鼎国生物技术有限责任公司)

1.2.2  HHW-21CU-600型电热恒温水槽(上海福玛实验设备有限公司)

1.2.3  752C型紫外、可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)

1.2.4  101-3A型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)

1.2.5  JY88-型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)

2 方法

2.1 各种细胞培养用液的配制

    DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗、新生牛血清FCS的灭活、谷氨酰胺液、完全型DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、2.5g/L胰蛋白酶液的配制方法参照实验一。

2.1.1 蛋白质标准液100μg/ml:称取小牛血清白蛋白10mg加生理盐水至100ml,制成100μg/ml标准液。

2.1.2 考马斯亮蓝G-250:考马斯亮蓝G-250 100mg,加95%乙醇50ml,加85%(W/V) H3PO4 100ml,加三蒸水稀释至1000ml,置棕色瓶过夜,用二层滤纸过滤,4贮存

2.1.3 茜素红溶液:将1g tris 液溶解于100ml三蒸水,再加入0.1g茜素红,用滴管加浓盐酸液,将PH值调整为4.04贮存 

2.1.4 100 mM /L氯化十六烷基吡啶鎓溶液:氯化十六烷基吡啶鎓的分子量为358,根据公式:质量=分子量×物质的量计算得出将3.58g氯化十六烷基吡啶鎓粉剂溶解于100ml三蒸水,即可制得100 mM /L氯化十六烷基吡啶鎓溶液,4贮存

2.1.5 0.05%TritonX-100溶液:取50μl TritonX-100D-Hanks缓冲液相混合,37水浴2h,使其充分溶解混匀。4贮存

2.1.6 地塞米松储存液:将3.92g地塞米松溶解于100ml无水乙醇,即可制得0.1mol/L的地塞米松母液,再取1ml母液,加入到9mlD-Hanks缓冲液中,即可制得0.001mol/dl的地塞米松储存液。抽滤除菌,4贮存。使用时用D-Hanks缓冲液稀释至所需浓度即可。

2.1.7 维生素C储存液:取0.5g的维生素C粉剂溶解于100ml D-Hanks缓冲液中,即可制得0.5g/dl的储存液。抽滤除菌,-20贮存。

2.1.8 β-甘油磷酸钠储存液:取3.15gβ-甘油磷酸钠溶解于10ml D-Hanks缓冲液中,即可制得0.1mol/dlβ-甘油磷酸钠储存液,抽滤除菌,4贮存。

2.1.9 矿化诱导液:现将地塞米松储存液用D-Hanks缓冲液稀释成10µmol/L的地塞米松溶液,取1ml地塞米松溶液、1ml维生素C储存液,1mlβ-甘油磷酸钠储存液与97ml完全型DMEM相混合,即可制得矿化诱导液(含100nM/L地塞米松,10 mM /Lβ-甘油磷酸钠,及50ug/ml的维生素C)。

2.2 PVA涂层24孔板的制备

称取10g可溶性PVA(聚合度为1750±50)倒入200ml20蒸水中,边倒入边搅拌,使其充分溶胀后,于95恒温水浴箱中放置2.5h,制成5 wt%PVA溶液。取24孔聚苯乙烯细胞培养板,每孔加入PVA溶液200μl后,置于60干燥箱内干燥24h,使其表面形成一层PVA薄膜,紫外线照射消毒24h,即制成PVA涂层培养板[37]

2.3 矿化诱导

取实验一所培养的生长良好的第4代牙髓细胞以4.5×104/孔的密度分别接种于PVA涂层24孔板和普通24孔聚苯乙烯培养板,实验分为ABC 3组, A组为PVA涂层培养板接种牙髓细胞后用完全型DMEM培养,B组为普通24孔培养板接种牙髓细胞后用矿化诱导液培养(矿化诱导培养液为添加了100nM/L地塞米松,10 mM /Lβ-甘油磷酸钠,及50ug/ml的维生素C的完全型DMEM培养液)。C组为普通24孔板接种牙髓细胞后用完全型DMEM培养液培养。

2.4 ALP活性检测

分别在矿化诱导后的第147d,取各组细胞进行ALP活性检测。检测方法:吸弃培养液,D-Hanks液洗3次,2.5 g/L的胰酶消化后,1000r/min离心5min,弃去上清液,D-Hanks液漂洗,1000r/min离心5min,弃上清,加入200μl 0.05%TritonX-100重悬,轻轻吹打混匀,置4冰箱内放置12h。加100μlD-Hanks液,轻轻吹打1min后超声处理。超声条件:150W5s,间隔10s,重复5[38]。考马斯亮蓝法测定培养细胞的蛋白质含量。用分光光度计依照ALP试剂盒内的使用说明书测吸光度A值,并根据说明书上的公式计算ALP活性[37]。计算公式:碱性磷酸酶(u/gprot=测定管吸光度÷标准管吸光度×标准管含酚的量÷取样中蛋白含量(g

2.5 定量茜素红染色分析

分别在矿化诱导后的第147d,取各组细胞进行定量茜素红染色分析:吸弃培养液,D-Hanks液洗3次,70%乙醇固定10minpH 4.0的茜素红溶液室温下染色1h。染色后,再用70%乙醇固定10min,蒸馏水洗3次,加入100 mM /L氯化十六烷基吡啶鎓处理1h使结合钙盐的茜素红溶解释放于溶液中。用分光光度计在562nm波长下测量吸光度。以吸光度/蛋白含量间接反映钙盐沉积的量(用考马斯亮蓝法测定培养细胞的蛋白质含量,蛋白含量的单位为毫克),即数值单位为A/mg[39]

2.6 Von Kossa染色

A组细胞连续培养4周后,行Von Kossa染色:以95%乙醇固定15min,三蒸水冲洗1次,5%硝酸银液浸染,紫外线照射30min后自来水充分冲洗5 min,加入5%硫代硫酸钠溶液,10minD-Hanks液洗3,浸入0.1 mol/L甲次砷酸钠溶液中,100W白炽灯照射10min,再以三蒸水冲洗1, 95%乙醇和无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。光镜下观察,阳性反应为出现黑色沉淀[40]

2.7 统计分析

    采用SPSS 11. 5 软件进行统计分析,间及组内比较运用重复测量的单因素方差分析检验水准α= 0. 01

3 结果

3.1 各组ALP活性比较

AB两组的ALP活性在培养的147d各时间点均明显高于C组,差异有统计学意义(p<0.01)。且随着培养时间的延长呈持续增高的趋势(p<0.01)。其中A组最高,在各时间点上均明显高于B组(p<0.01)。而C组在7d的培养过程中不具有持续升高趋势(表1)。

3.2各组钙盐沉积的量比较

AB两组的钙盐沉积量在培养的147d各时间点均明显高于C组,差异有统计学意义(p<0.01)。且随着培养时间的延长呈持续增高的趋势(p<0.01)。其中A组最高,在各时间点上均明显高于B组(p<0.01)。而C组在7d的培养过程中不具有持续升高趋势(表2)。

3.3 Von Kossa染色结果

A组细胞经PVA连续诱导培养4周左右,在细胞团中央Von Kossa染色为阳性,阳性区位于结节中央,染色深褐色,周围逐渐变浅(5),提示细胞结节中有明显的钙盐沉积。

4 讨论

PVA是一种有机高分子聚合物,为白色固体,外型分絮状、颗粒状、粉状三种,可以在95以下的热水中溶解,其水溶液有很好的粘接性和成膜性,广泛应用于化工业、纺织业、医药卫生业等领域。PVA在医学领域的应用主要有以下几个方面:①PVA水凝胶由于具有与人体各组织相近的含水量、弹性模量、低摩擦系数及较高的机械强度、丰富的孔洞网络结构、良好的生物相容性等特点,在生物医学领域有着广泛的应用,如人工软骨材料、药物缓释载体、细胞微囊及微生物的包埋固定化、眼科等[41]。②抗凝血型材料:将肝素与PVA-海藻酸钙网状高分子材料有机结合后的新型材料具有良好抗凝血性能和生物相容性,并且仍能保留结合肝素前的强度和高弹性[42]。③智能型生物载体材料:智能化生物材料一般指能模仿生命系统,同时具有感知、反馈、响应等要素的新型功能材料[43]。例如,在PVA基体上接枝N一异丙基丙烯酰胺(NI-PAAm)类均聚物及共聚物薄层,能够进一步发挥该聚合物的良好开关性能[44],而且大大提高了其机械强度,扩大该类材料的应用领域。通过控制温度或pH值来调节聚合物的溶胀和消胀,可制成具有开关功能的药物控释载体。④生物医用海绵:孙瑞焕等[45]制成了多孔泡沫海绵状的离子化PVA海绵,(简称I-PVA海绵),具有良好的生物相容性、化学稳定性及亲水吸液、吸血性能,可用于创伤止血。聚乙烯醇缩甲醛海绵可用来制造人造皮肤、人造肌肉、人工角膜等。⑤组织工程支架材料:目前在这方面的研究不多,郭大刚等[46]通过湿法合成制备了直径10-20 nm、长30-40 nm的短棒状纳米HA,用PVA作为表面分散剂对HA纳米颗粒进行了表面改性实验,发现经PVA包覆后的HA纳米颗粒克服了易发生强烈团聚的缺陷,促进了HA纳米颗粒纳米性能的发挥为以后进一步制备纳米HA增强PVA水凝胶组织工程支架材料提供了可能性。本实验研究发现PVA本身即可诱导牙髓细胞矿化分化,加之先前Rung-Shu Chen[37]研究表明PVA可通过抑制ERK1/2的磷酸化的方式矿化诱导牙胚细胞,从另一侧面证明了PVA将来作为支架材料应用于牙组织工程领域的潜在可能性。

本实验所采用的含一定比例的地塞米松、维生素Cβ-甘油磷酸钠的完全型DMEM培养液,是目前最常用的矿化诱导液。其中维生素C是合成胶原和骨形成的必需物质,地塞米松具有促进成骨细胞分化成熟、诱导成骨、有调节成骨样细胞产生胰岛素样生长因子和促进胶原合成、刺激碱性磷酸酶活性的作用。β-甘油磷酸钠能够为矿化提供必需的磷离子。

ALP是参与骨和牙齿等矿化组织形成、代谢和再生的重要物质,可通过调控磷酸盐的转运而参与骨和牙本质形成,ALP活性增强,被认为是牙髓细胞向成牙本质细胞分化和牙本质形成的早期标志。故本实验采用测定ALP活性的指标,并通过与常规矿化诱导液、普通的完全型DMEM培养液相对照的方法,来评定PVASD大鼠牙髓细胞的矿化诱导作用。由于测ALP活性时需裂解细胞,固本试验参考李德华等人的方法,采用机械与化学结合的方式破碎细胞,即0.05%TritonX-100结合超声细胞破碎仪来裂解大鼠牙髓细胞,结果证明这是一种行之有效的方法。

Bouvier[47]将牙髓细胞接种于含有硫酸软骨素的三维培养基中进行培养,首次发现了牙髓细胞体外培养时的钙化现象。Tsukamoto[48]通过实验得出结论,体外牙髓细胞呈复层生长的能力是细胞形成结节的先决条件,而细胞结节具有的三维结构又是矿化的先决条件。经检测这种矿化结节主要为牙本质样的矿化基质,具有牙本质的特性。因此,矿化结节的出现被作为牙髓细胞向成牙本质细胞分化的标志。近年来,随着技术的进展,许多学者对矿化结节做了半定量和定量的分析。杨雪超等[49]详细记录了牙髓细胞体外连续传代时矿化结节的数目及面积随培养代次的增加而减少的现象,符合体外连续培养导致牙髓细胞分化能力下降的论点。本实验参考Ratisoontorn C[39]的方法,进行了量化的茜素红染色分析,从而有直观的数值比较矿化诱导液培养组及PVA培养组的钙盐沉积量,并通过对PVA诱导组进Von Kossa染色,结果形成了钙化结节,进一步证明了PVASD大鼠牙髓细胞的矿化诱导作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

本实验采用组织块酶消化法体外培养SD大鼠牙髓细胞并进行鉴定,建立了牙髓细胞的体外培养体系,再取所培养的第四代牙髓细胞,分别以PVA、矿化诱导液进行矿化诱导,并以完全型DMEM培养基培养细胞进行对照,得出结论如下:

原代培养所获得的细胞SABC法对细胞爬片进行波形丝蛋白、角蛋白免疫组化染色,鉴定结果符合体外培养牙髓细胞的特征,结合显微镜观察细胞形态,及可被矿化诱导的特性,证实为SD大鼠牙髓细胞。

    组织块酶消化法进行大鼠牙髓细胞体外培养,在较短时间内即可获得足量存活的牙髓细胞,而且细胞形态类型多样,更能代表整个牙髓组织。是一种比单纯的组织块法和酶消化法更加优越的方法。

PVA本身即像矿化诱导液一样,可诱导牙髓细胞矿化分化,经PVA矿化诱导后的大鼠牙髓细胞其ALP活性,钙盐沉积量均持续升高,大鼠牙髓细胞经PVA连续矿化诱导4周后可形成矿化结节。因此,可进一步尝试将PVA制作成支架材料引入组织工程化牙髓牙本质复合体的研究当中。

综上所述,本实验证实了PVA作为牙组织工程支架材料的潜在可能性,但由于作者时间、经费、知识技能水平等主客观原因,尚有很多问题需要解决,例如:怎样将PVA制作成为适宜的、具有三维疏松多孔结构的组织工程支架材料,以及将牙髓细胞等种子细胞与制成的PVA支架材料相复合,动物体内移植构建牙髓牙本质复合体能否成功等尚有待进一步研究。相信在不久的将来,实现构建组织工程化牙髓牙本质复合体的目标,以及进一步实现生物牙再生的目标一定能够实现!


 

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1 3周龄清洁型SD大鼠。

2 原代培养的第7天,鼠牙髓细胞自牙髓组织边缘游出(100×,图中黑箭头所示为其中的一个牙髓细胞)

3 4SD大鼠牙髓细胞角蛋白阴性(400×)。

4 4SD大鼠牙髓细胞波形丝蛋白阳性(400×

5 PVA连续诱导培养4周的SD大鼠牙髓细胞,其产生的矿化结节Von Kossa染色为阳性200×

1 各组牙髓细胞ALP活性比较(x±s单位为u/gprot

2 各组牙髓细胞矿化量的比较(x±s单位为A/mg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

2

 3

4

5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

培养时间(d

    1                    4                    7

PVA涂层  A       52.837±2.878          106.735±5.005        143.837±5.367

矿化诱导液(B       32.637±2.599           66.628±0.652         84.662±1.104

空白对照  C        8.015±0.095           27.522±2.315         28.890±1.495

 

1注:表中每行为同一组内不同时间点相比较,ABp0.01;每列为不同组间同一时间点相比较,p0.01

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2注:表中每行为同一组内不同时间点相比较,ABp0.01;每列为不同组间同一时间点相比较,p0.01

 

 

 

培养时间(d

    1                    4                7

PVA涂层  A       0.827±0.074          0.947±0.067        1.190±0.129

矿化诱导液(B       0.068±0.005           0.464±0.058        0.553±0.006

空白对照  C       0.059±0.010           0.135±0.007        0.127±0.006


 

个人简历和研究成果

 

2000-2005   云南省昆明医学院              学生

2005-2007   山西省侯马市人民医院          住院医师

2007-2010   第四军医大学                  学员

 

 

庞楠 邹敬才 荀文兴等. PVA对大鼠牙髓细胞矿化诱导能力的实验研究


 

   

第四军医大学地处中国历史文化名城西安市区,校园环境幽雅、花木繁茂、碧草如茵、景色宜人,是读书治学的理想园地。能够进入这所古典幽雅、景色宜人的学府学习和工作,使我多年来的愿望和梦想,首先感谢第四军医大学为我提供了这样一次难得的机会,对临床学习和论文写作过程中关心、支持、理解、帮助过我的所有人们致以最诚挚的谢意。

在本论文即将完成之际,谨此向我的导师邹敬才教授致以衷心的感谢和崇高的敬意!本论文的工作是在邹教授的悉心指导下完成的。邹教授以他敏锐的洞察力、渊博的知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风和对科学的献身精神给我留下了深刻的印象,这些使我受益匪浅,并将成为我终身献身科学和献身事业的动力。 

在攻读硕士的这三年里,导师不仅为我创造了优越的科研和学习环境,使我得以在口腔医学知识的海洋中自由翱翔,同时在思想上、人生态度和意志品质方面给予了谆谆教诲,这些教益必将激励着我在今后的人生道路上奋勇向前。 

衷心感谢荀文兴教授,他不仅在科研实验中给予我关心和指导,在临床技能的培训上也对我耐心指导和热情帮助,在此我深表感谢!

感谢第四军医大学唐都医院口腔科及整形科全体老师和同学的热情关心和帮助,他们不仅从学术上给予我必要的指引,并且在生活中给予我很多的帮助,从他们身上我学到了许多知识。

真诚感谢第四军医大学唐都医院中心实验室的老师们和全体工作人员,他们在实验操作上给与我悉心的指导,并提供了许多实验必需的试剂及设备。

衷心感谢时刻关心着我的家人!没有他们的关心、鼓励和支持,无无法完成现在的硕士学业。

最后,再次诚挚的感谢所有帮助过、支持过、关心过我的人们。衷心地感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们!

 

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